Cổng thông tin quan trắc môi trường

Giới hạn định lượng của phương pháp là 21 pgTEQ/g. Độ đúng của phương pháp nằm trong khoảng 79,5 - 129,7 %; độ lặp lại thể hiện thông qua giá trị độ lệch chuẩn tương đối (RSD) trung bình nằm trong khoảng từ 10 - 15 % với thí nghiệm sử dụng 3 mẫu đất ở các mức nồng độ khác nhau (n=7). Quy trình đáp ứng yêu cầu phân tích, đánh giá chất lượng đất theo quy định tại các QCVN, TCVN hiện hành về ngưỡng dioxin trong các loại đất.

 1. Đặt vấn đề

    Dioxin là nhóm các hợp chất hữu cơ khó phân hủy, chỉ với một lượng nhỏ đã có thể gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe con người ^{[2, 3, 10]}. Phân tích dioxin là vấn đề phức tạp, đòi hỏi cao về kỹ thuật, chi phí đầu tư do phương pháp phân tích tiêu chuẩn quốc tế hiện nay chủ yếu thực hiện trên hệ thiết bị sắc ký khí ghép nối detectơ khối phổ phân giải cao (HRGC/HRMS). Gần đây, với sự tiến bộ của công nghệ hóa - sinh, kỹ thuật phân tích dioxin bằng các phương pháp sinh học đã ra đời. Trong đó, phân tích dioxin bằng phương pháp Immunoassay đã được phát triển, có hiệu quả với kỹ thuật đơn giản hơn, độ nhạy đáp ứng yêu cầu, thời gian phân tích ngắn và chi phí cũng thấp hơn so với phương pháp HRGC/HRMS^{[8, 12]}.

    Để triển khai thêm phương pháp phù hợp với điều kiện Việt Nam, nghiên cứu này nhằm tối ưu quy trình xử lý mẫu (chiết tách, làm sạch) và xác nhận giá trị sử dụng quy trình phân tích tổng dioxin trong đất bằng phương pháp thử nghiệm miễn dịch Immunoassay.

    2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

    2.1. Đối tượng nghiên cứu

    Quy trình phân tích tổng độ độc tương đương của 17 chất dioxin/furan có độc tính theo danh mục của WHO (viết tắt là tổng TEQ dioxin) trong mẫu đất ^[9].

    2.2. Vật liệu, thiết bị nghiên cứu

    2.2.1.  Hóa chất

    - Các dung dịch chuẩn dioxin (2,3,7,8-TCDD): Dung dịch dựng đường chuẩn với nồng độ tương ứng: 0; 0,064; 0,2; 0,64 và 2,0 pg/µL; dung dịch thêm chuẩn nồng độ 100 pg/µL; hãng CAPE Technologies, Mỹ hoặc tương đương;

    - n-Hexan (C₆H₁₄); Diclometan (CH₂Cl₂); Axeton (CH₃COCH₃); Toluen (C₆H₅CH₃);

    - Vật liệu hấp phụ silicagel 60 mesh, than hoạt tính chuyên dụng cho phân tích dioxin (hãng Supelco hoặc tương đương);

    - Dung dịch giữ (Keeper solution): hỗn hợp Metanol: Tetraetylen glycol (80:20) + 100 mg/L Triton X-100.

    Các hóa chất có độ tinh khiết dùng cho phân tích hoặc chuyên dùng cho phân tích sắc ký.

    2.2.2. Dụng cụ, thiết bị

    - Cân phân tích (cân kỹ thuật có khả năng đọc bằng 10 mg hoặc tốt hơn); máy lắc ngang có thể đạt được tốc độ 350 vòng/phút; máy ly tâm với ống ly tâm loại ống nghiệm 15 ml và 40 ml; cột thủy tinh nhồi vật liệu hấp phụ silicagel (6 g) và than hoạt tính (0,5g); thiết bị cô N₂ có bộ phận gia nhiệt lên đến 75^oC để bay hơi toluen;

    - Thiết bị đo quang PCII 5870062, hãng Hach, Mỹ;

    - Hệ thiết bị HRGC/HRMS, model DFS, hãng Thermo, Đức (phân tích kiểm tra chéo với phương pháp Immunoassay);

    - Bộ dụng cụ đo Immunoassay Kit DF1-60, hãng Cape Technology, Mỹ;

    - Các dụng cụ phụ trợ và dụng cụ bảo hộ phòng thí nghiệm.

    2.3. Khảo sát, tối ưu quy trình xử lý mẫu đất phân tích dioxin

    Tổng TEQ dioxin trong mẫu đất được phân tích định lượng dựa trên kỹ thuật phân tích miễn dịch sử dụng kit Enzyme Immunoassay (EIA) chứa kháng thể đặc trưng với dioxin/furan. Quy trình chuẩn bị mẫu, phân tích gồm: Chiết, làm sạch, làm giàu dịch mẫu, ủ mẫu với kit EIA và đo mật độ quang tại bước sóng 450 nm trên thiết bị đo quang phổ. Nồng độ dioxin/furan trong mẫu tỷ lệ nghịch với cường độ màu của dung dịch phân tích ^{[6, 7, 12]}.

    2.3.1. Khảo sát quy trình chiết mẫu

    * Khảo sát lựa chọn phương pháp chiết mẫu: Khảo sát phương pháp chiết là chiết lắc ngang và chiết siêu âm, là hai phương pháp đơn giản thường sử dụng cho chiết mẫu đất. Thử nghiệm hai loại dung môi chiết phổ biến là hỗn hợp nHexan:Diclometan, tỷ lệ 1:1; nHexan:Axeton, tỷ lệ 1:1, thể tích 20 ml ^{[11, 12]}. Mỗi thí nghiệm được lặp 3 lần với mẫu thêm chuẩn (nồng độ dioxin là 30 pgTEQ/g) trên nền mẫu có nồng độ thấp để đánh giá độ thu hồi và độ lặp lại.

    * Khảo sát tối ưu khối lượng mẫu chiết: Thực hiện thí nghiệm trên cùng một mẫu đất với 3 mức khối lượng mẫu chiết là 1g, 5g và 10g; thêm 50 µl chuẩn dioxin nồng độ 01 pg/g vào từng mẫu; sử dụng phương pháp chiết đã khảo sát được. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 03 lần, để đánh giá độ thu hồi và độ lặp lại.

    2.3.2. Tối ưu quy trình làm sạch dịch chiết mẫu

    * Khảo sát khối lượng vật liệu nhồi cột làm sạch: Khảo sát trên hệ cột silicagel axit với ba mức khối lượng vật liệu nhồi cột silicagel là 3g, 6g, 10g và cột than hoạt tính với mức khối lượng thông thường là 0,5g. Thí nghiệm trên các mẫu đất thêm chuẩn trên nền mẫu đất nồng độ thấp với nồng độ dioxin thêm vào là 30 pgTEQ/g. Tiến hành chiết mẫu theo các điều kiện đã tối ưu, sau đó làm sạch dịch chiết bằng các bộ cột tự chuẩn bị và cột nhồi sẵn thương phẩm hãng Cape Technologies để đối chiếu. Các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần, để đánh giá độ thu hồi, độ lặp lại.

    * Tối ưu quy trình rửa giải: Sau khi khảo sát tối ưu được khối lượng vật liệu nhồi cột thích hợp, tiến hành thí nghiệm tối ưu thể tích dung môi Toluen rửa giải chất phân tích ở các mức 20 ml và 30 ml.

    2.4. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp

    Nội dung xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp được thực hiện theo các quy định tại Thông tư số 24/2017/BTNMT quy định kỹ thuật về kỹ thuật quan trắc môi trường (nay là Thông tư số 10/2021/BTNMT) và các hướng dẫn về phê duyệt phương pháp của AOAC, US EPA… ^{[1, 4, 5]}

    3. Kết quả và bàn luận

    3.1. Khảo sát quy trình xử lý mẫu

    3.1.1. Lựa chọn phương pháp chiết mẫu

    Kết quả ở Hình 1 cho thấy, các phương pháp có độ thu hồi trung bình nằm trong khoảng 69% - 110%, đáp ứng tiêu chí về độ thu hồi của phương pháp là 100 ± 30%. Trong 4 trường hợp khảo sát, phương pháp chiết lắc ngang với hỗn hợp dung môi nHexan:Axeton (1:1) có độ thu hồi tốt và độ lặp lại cao nhất (giá trị RSD thấp nhất 5,7%). Do đó, phương pháp này được lựa chọn làm phương pháp tối ưu và áp dụng cho các thí nghiệm nghiên cứu hoàn thiện quy trình tiếp theo.

Hình 1. Kết quả độ thu hồi trung bình và độ lặp lại của 4 phương pháp chiết mẫu

    3.1.2. Tối ưu khối lượng mẫu sử dụng để chiết tách

    Kết quả tối ưu khối lượng mẫu sử dụng để chiết tách được trình bày trong Hình 2 cho thấy, với khối lượng mẫu chiết là 5g, 10g, thí nghiệm có độ thu hồi và độ lặp lại tốt, nằm trong khoảng 100 ± 20%, đạt tiêu chí chấp nhận theo quy định của phương pháp tiêu chuẩn quốc tế hay hướng dẫn của AOAC ^{[4, 12]}. Khối lượng mẫu 5g được lựa chọn làm khối lượng tối ưu để áp dụng cho quy trình chiết mẫu.

Hình 2. Kết quả tối ưu khối lượng mẫu chiết

     3.1.3. Tối ưu quy trình làm sạch dịch chiết mẫu

    * Khảo sát khối lượng vật liệu nhồi cột làm sạch:

Hình 3. Kết quả khảo sát khối lượng vật liệu nhồi cột làm sạch

    Hình 3 cho thấy, hệ cột tự chuẩn bị với 6g silicagel cho hiệu suất thu hồi cao (92,4%); giá trị RSD là 11,85%, tương đương với cột nhồi sẵn thương phẩm. Như vậy, phương pháp làm sạch sử dụng cột tự chuẩn bị 6g cho hiệu suất tốt, chi phí thấp, quá trình thực hiện thí nghiệm cũng đơn giản, phù hợp với điều kiện các phòng thí nghiệm tại Việt Nam.

    * Tối ưu quy trình rửa giải: 

    ​Bảng 1. Kết quả tối ưu thể tích dung môi rửa giải

        Kết quả trong Bảng 1 cho thấy, ở cả 2 thí nghiệm đều có hiệu suất thu hồi (R) trung bình và độ lặp lại nằm trong khoảng cho phép là 100 ± 20%; với thí nghiệm có thể tích Toluen rửa giải 30 ml thu được hiệu suất thu hồi trung bình cao hơn khoảng 5%, độ chụm tốt hơn. Như vậy, cả 2 mức thể tích dung môi này đều có thể áp dụng cho làm sạch mẫu đất; tùy theo điều kiện tối ưu về thời gian hay tiết kiệm chi phí dung môi mà phòng thí nghiệm có thể lựa chọn. Trong nghiên cứu này, thể tích dung môi rửa giải là 30 ml Toluen được áp dụng.

    3.2. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp

    3.2.1. Độ nhạy, độ chọn lọc

    Kết quả phân tích trên mẫu trắng (DATIM1) và 3 mẫu đất thêm chuẩn với nồng độ 20 pgTEQ/g xấp xỉ giá trị LOQ ước lượng (DATIM1_Spike_1 ÷ DATIM1_Spike_3) trong cùng điều kiện cho thấy, mẫu trắng DATIM1 không phát hiện dioxin; 3 mẫu thêm đã phát hiện và định lượng được tổng TEQ dioxin với các giá trị lần lượt là 21,4; 23,9; 19,9 pgTEQ/g.

    3.2.2. Đường chuẩn phân tích dioxin

    Thực hiện phân tích 5 mẫu dung dịch chất chuẩn dioxin (2.3.7.8-TCDD) có nồng độ 0; 0,064; 0,2; 0,64 và 2 pg/uL (tương ứng với nồng độ chuẩn 0; 3,2; 10; 32; 100 pgTEQ/ống EIA). Đường chuẩn là đường cong phi tuyến tính biểu diễn tương quan giữa nồng độ TEQ trong mỗi ống EIA với phần trăm kiểm soát sai lệch âm (percent negative control) mật độ quang ^[12]: Y=(58/(1+(X/9,1)^1,77)) + 41,6 được trình bày trong Hình 4.

Hình 4. Đường chuẩn phân tích dioxin bằng phương pháp Immunoassay

    ​3.2.3. Giới hạn phát hiện (MDL), giới hạn định lượng (LOQ)

    Giá trị MDL được xác định ở nồng độ ứng với giá trị mật độ quang kiểm soát sai lệch âm là xấp xỉ 85% trên đường chuẩn (I₈₅) ^[12]. Giá trị MDL tính toán được là 4,9 pgTEQ/ống tương đương với xấp xỉ 7 pgTEQ/g mẫu đất. Giá trị LOQ được xác định theo công thức: LOQ = 3,33 x MDL = 21 pgTEQ/g mẫu đất. Giá trị MDL này phù hợp theo công bố trước đây trong phương pháp Immunoassay phân tích sàng lọc dioxin/furan - EPA Method 4025 - là 3,5 ± 1,4 pgTEQ/ống đồng thời nhỏ hơn nhiều lần so với các ngưỡng cho phép của dioxin trong đất quy định tại các tiêu chuẩn Việt Nam, quy chuẩn Việt Nam; đáp ứng được yêu cầu phân tích đánh giá chất lượng đất ^[12].

    3.2.4. Đánh giá độ chụm, độ đúng

    * Độ chụm, độ đúng:

    Kết quả thí nghiệm xác định độ chụm, độ đúng của phương pháp với mẫu đất thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ (C), số thí nghiệm lặp lại n = 7, được trình bày trong Bảng 2. Giá trị độ chụm thể hiện qua RSD (%) và độ đúng thể hiện qua độ thu hồi R (%).

    Bảng 2. Kết quả đánh giá độ chụm, độ thu hồi phân tích tổng dioxin bằng phương pháp Immunoassay

    Kết quả độ đúng của phương pháp nằm trong khoảng 79,5 - 129,7 % (trung bình là 80,4 - 119,8%) và RSD trung bình nằm trong khoảng từ 10 - 15 %. Kết quả này đáp ứng theo tiêu chí của Hiệp hội các nhà hóa học phân tích AOAC khoảng chấp nhận đối với độ đúng của phương pháp phân tích mẫu có nồng độ ≤ 1 ppb là 40% - 120% ^[4]. Đối với các mẫu phân tích dioxin có nồng độ ở mức hàm lượng vết cỡ ppt (pg/g) nhỏ hơn 1.000 lần so với ppb, do vậy, có thể xem xét lựa chọn tiêu chí chấp nhận của độ đúng, độ chụm của phương pháp là 100% ± 30%.

    * Phân tích kiểm tra chéo với phương pháp US EPA Method 1613:

    Để khẳng định hơn về độ chính xác của phương pháp Immunoassay, 3 mẫu được lựa chọn để phân tích, kiểm tra chéo trên thiết bị HRGC/HRMS theo phương pháp US EPA Method 1613 ^[11]. Kết quả phân tích bằng hai phương pháp có độ chụm tốt, giá trị phần trăm sai khác tương đối (RPD) đều < 30%, đạt tiêu chí chấp nhận về độ sai khác đối với phân tích thông số có nồng độ vết như dioxin.

    ​Bảng 3. Kết quả phân tích chéo với phương pháp HRGC/HRMS

    5. Kết luận

    Kết qủa nghiên cứu là cơ sở khoa học để hoàn thiện quy trình phân tích tổng dioxin trong đất bằng phương pháp Immunoassay với độ tin cậy cao; phương pháp thực hiện đơn giản, thời gian phân tích ngắn và đặc biệt là chi phí thấp hơn so với phương pháp HRGC/HRMS; có thể ứng dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm quan trắc môi trường tại Việt Nam; đáp ứng yêu cầu đánh giá chất lượng đất theo quy định tại các tiêu chuẩn, quy chuẩn Việt Nam hiện hành về dioxin/furan trong đất.

Nguyễn Thị Minh Huệ, Hoàng Thị Liên, Nguyễn Thị Hà Phương, Lê Thị Hải Châu, Nguyễn Như Tùng, Nguyễn Thị Nguyệt Ánh, Nguyễn Hùng Minh